Hintergrund und Zielsetzungen:

Über die Stabilisierung des Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF) unter normoxischen Bedingungen ist nicht viel bekannt. Wir hypothetisieren, dass Mikromilieufaktoren (MF) eine normoxische HIF-1α-Stabilisierung induzieren können und dadurch zum Verlust der endothelialen Barrierefunktion (EBF) und damit die Entwicklung der Atherosklerose triggern können. Hierfür wird in dieser Arbeit eine systematische Analyse der Wirkung von MF auf die HIF-1α-Stabilisierung unter normoxischen Bedingungen durchgeführt. Funktionelle Charakterisierung der HIF-1α stabilisierenden MF wird im Hinblick auf die EBF und die Modulation des Endothelzellsekretoms als zweites Ziel dieser Arbeit untersucht.

Methoden:

Um HIF1α-stabilisierende MF anhand der live cell imaging Versuche entdecken zu können, generierten wir HIF-1α-mKate2 exprimierenden HEK293-Zellen als tiefroten Biosensor. Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) wurden dann mit vorselektierten MF behandelt. Die normoxische HIF-1α-Stabilisierung wurde im live cell imaging und mit Mikroskopie-unabhängigen Methoden wie Western Blot bestätigt.

Ergebnisse:

Wir konnten nachweisen, dass MF, insbesondere pro-inflammatorische Zytokine und Wachstumsfaktoren wie z.B. TNF-α und IGF-I, eine signifikante normoxische HIF-1α-Stabilisierung in HCAECs verursachen. Die normoxische HIF-1α-Stabilisierung durch MF ist unabhängig von Schritten, die zum Abbau dieses Transkriptionsfaktors unter normoxischen Bedingungen führen, wie z.B. der Hydroxylierung. Denn die Menge des Prolyl-4-Hydroxylase-2 (PHD2)-Proteins sowie des hydroxylierten HIF-1α-Proteins ändert sich nach der normoxischen HIF-1α-Stabilisierung nicht. Hingegen aktivieren MF den Akt/mTOR-Signalweg sowie den MEK/ERK-Signalweg. Dies führt zur Phosphorylierung und Aktivierung der P70S6 Kinase sowie des eukaryotischen Translations-Initiationsfaktors 4E (eIF4E), was zur Hochregulation des HIF-1α-Proteins führt. Auch wird der NF-κB-Signalweg aktiviert, was indirekt zur normoxischen Hochregulation des HIF-1α-Proteins durch MF beiträgt.

Schlussfolgerung: